의과학 | Bradford method를 이용한 단백질 정량
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작성자 캠프 담당자 작성일17-07-08 19:28 조회5,628회 댓글0건본문
국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프
Bradford method를 이용한 단백질 정량
1.실험목표
특정 단백질을 흡광도를 이용하여 정량하고 단백질 정량하는 방법에는 어떤 것들이 있으며 그 차이점을 이해, 또한 시약 제조 및 농도 계산법을 이해하도록 한다.
2. 실험재료
Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, Potassuim Tartarate (각 시약 1통), 증류수(말통 하나), BSA(Bovine serum albumin - 1병), folin-phenol regent (1병), Na3C6H5O7․2H2O
3. 실험기구
spectrophotometer elisa plate reader (1대), 전자저울 (1대), Micro pipet(1000ul, 100ul, 10ul & 각 팁 조당 1개 & 1box씩), vortex (반에 1대), microtube(1.5ml -2봉지), 각 tube rack (조당1개씩), 15ml tube, 50ml tube(조당 4개씩), 라텍스(1반에 1Box), 네임펜 (조당 1개), 노트북 (반에 1대), pipet(10ml 각 조당 3개씩)
4. 실험방법
<Lowry method>
1. 시약 만들기
- Reagent A : 1g의 Na2CO3 in 0.2g의 NaOH in dw 50ml
- Reagent B : 0.1g CuSO4.5H2O, 0.2g의 Na3C6H5O7․2H2O
in 20 ml distilled water
- Reagent C : 0.2 g Potassuim Tartarate in 10ml distilled water
2. 위의 reagent A: 9.8 ml 에 B : 0.1 ml , C : 0.1 ml을 차례로
15 ml tube에 넣고 섞어준다.
3. E-tube에 protein양을 정확히 알지 못하는 milk를 희석한다
(총 20ul가 되게 함)
sample A - 1/2: DW 10ul + milk 10ul
sample B - 1/5: DW 12ul + milk 8ul
sample C - 1/10: DW 10ul + 1/5 10ul
sample D - 1/50: DW 16ul + 1/10 4ul
4. BSA로 standard 를 만든다. ( stock : BSA 1mg/ml )
| 0.5mg/ml | 1 mg/ml | 2 mg/ml | 3 mg/ml | 4 mg/ml |
BSA [㎕] | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 |
H2O [㎕] | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 |
合 [㎕] | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
5. standard와 sample을 96well에 2ul씩 넣는다.
<그림1. 희석된단밸질과 lowry와 뷰렛시약을 etube에 준비하는 모습이다. >
6. 각 standard 와 sample 에 위에서 만든 solution 178ul 씩 넣고 vortexing 한다.
7. room temp.에서 15분간 방치한다.
8. folin-phenol reagent를 D.W와 1:1 dilution 하여 (400ul : 400ul) 하여 800ul을 만든다.
9. 각 standard 와 sample에 folin-phenol reagent를 20ul 를 가하고 바로 vortexing 한다. (Total volume 200ul)
10. room temp.에서 30분간 방치한다.
11. Elisa reader로 660 nm에서 흡광도를 잰다.
12. standard curve를 그리고, 단백질량을 계산한다.
<Bradford method>
1.BSA로 standard 를 만든다. ( stock : BSA 1mg/ml )
| 0.5 mg/ml | 1 mg/ml | 2 mg/ml | 3 mg/ml | 4 mg/ml |
BSA [㎕] | 0 | 20 |
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