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의과학 | 단백질 전기 영동법을 통한 내분비 교란 단백질양 발현 비교

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작성자 캠프 담당자 작성일17-02-07 10:31 조회809회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프

<단백질 SDS-PAGE기법과 coomassie 염색을 이용한 단백질 발현 비교> 

 

 

1.실험목표

단백질 SDA-PAGE기법을 이용한 전기장에 따른 단백질 분리 원리에 대하여 알아보고, 환경호르몬 노출 정소조직에서 coomassie염색을 이용한 단백질 발현을 비교해보자

 

2. 실험재료

환경호르몬에 노출된 마우스 또는 렛, 아세트산 (acetic acid)

메탄올 (methanol)

 

3. 실험기구

PowerPac Basic (300v/400mA/75w) MP Tetra cell, 1.0mm 10-well mini-protean TGXTM stain-free precast gels (4-15% Resolving gel) 1X RIPA lysis buffer, 50ml coomassie blue R-250 staining solution 10x Tris/Glicine/SDS, 1L precision plus protein ustained standards (1000ul), hot plate, 비이커, 유리막대, 락앤락 글라스 반찬통, 파이펫 (20100-200ul)과 팁, 1.5ml etube, 1.5ml 튜브 원심분리기

 

4. 실험방법 

 

실험1> 단백질 전기영동

 

1. 환경호르몬에 노출된 마우스를 경추탈골로 안락사 시킨후 해부도구 세트를 이용하여 해부판에서 정소조직을 5mmX5mm로 채취한다.

 

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<그림1. 환경호르몬을 투여한 마우스로부터 정소를 적출하는 모습이다.>

 

2. 얻은 조직을 잘게 자른후 (아이스팩 위에서) e-Tube에 넣는다. lysis 버퍼를 300ul를 넣고 잘 파이펫팅 하여 lysis 시킨다

 

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<그림2. 정소조직에 lysis 버퍼를 넣은 모습이다.>

 

3 3000rpm 5분간 원심분리후 상층액만 잘 따서 새로운 튜브에 옮긴다.

 

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<그림3. lysis 된 정소조직의 모습이다.>

 

4. 80ul를 옮긴후 5x sample버퍼와 섞은후 끓는 물에서 5-10분간 가열한다.

 

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<그림4. 5x sample 버퍼를 넣고 끓인후의 모습이다.>

 

5. 원하는 단백질 사이즈에 맞는 젤을 전기영동장치에 조립후 전기영동 버퍼를 넣는다.

 

6. 마이크로 파이펫으로 조심스럽게 시료를 20ul 채취후 로딩한다.

 

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<그림5. 마이크로파이펫으로 시료를 채취하는 모습이다.>

 

7. 75v에서 약 20-30분간 전기영동후 120v에서 약 1-1.5시간동안 전기영동을 한다.

 

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<그림6. 전기영동장치에서 전기영동하는 모습이다.>

 

 

 

 

실험2> 단백질 전기영동

전기영동이 끝난후 gel을 전기영동장치에서 분리한다.

 

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<그림7. 전기영동장치에서 젤을 분리한 모습이다.>

 

2. 조심스럽게 gel을 오려낸다. 이때 젤이 마르지 않게하고 찢어지지 않게 조심한다.

 

3. 젤을 염색용기에 옮긴후 0.25gcoomassie blue G250, 10% acetic acid, 40% methanol로 조성된 염색약을 젤이 담길정도로 붙고 염색시킨다. 30-1시간.

 

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<그림8. 쿠마씨 염색약에 젤을 담고 염색시키는 모습이다.>

 

4. 염색이 끝난후, 염색약을 조심스럽게 제거한 후 10% acetic acid, 40% methanol로 된 탈염색용액을 넣어 반응시킨다.

 

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<그림9. 탈염색 용액에 젤을 넣고 탈염색하는 모습이다.>

 

5. 탈염색과정이 끝난후 나타나는 밴드를 비교해본다.

 

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<그림10. 탈염색후 단백질 밴드를 비교하는 모습이다.>

 

 

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