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생명과학 | Plasmid DNA를 이용한 제한효소 처리 및 유전공학 기초 이해

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작성자 캠프 담당자 작성일17-01-17 17:31 조회473회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험토론캠프

 

 

1.실험목표

 

- plasmid DNA에 직접 제한효소를 처리할 수 있다.
- 젤 전기영동을 통해 제한효소 처리 결과를 보고 제한효소의 역할을 이해할 수 있다. 또한 결과를 통해 DNA map을 작성할 수 있다.

  

 

2. 실험재료

 

plasmid DNA, restriction enzyme, 10X reaction buffer(NaCl, TrisCl, MgCl2, Dithiothreitol, KCl ), 10X PCR reaction buffer, 프라이머(10pmol), Taq polymerase, D.W, 10X reaction buffer, 1XTAE buffer, 아가로오즈 겔 파우더, gel red, DNA loading dye, DNA size marker(1Kb), spin column, lysis buffer, 70%에탄올, wash buffer

 

  

 

3. 실험기구

 

PCR 기기, micro pipet과 피펫 팁, 아이스팩, PCR tube, PCR tube rack, 1.5ml tuberack, 호일랩, 폴리글러브, 라텍스 글러브, Et-OH 분무기, 네임펜, 전기영동장치, UV light, gel tray, microwave oven, 전자저울, 약수저, 삼각플라스크, 거름종이, 핸드페이퍼, 원심분리기

 

 

 

4. 실험방법 :

 

. Polymerase Chain Reaction

1. 전체 실험은 PCR 기기에 넣기 전까지 아이스팩 위에서 진행한다.

 

 

Amount(μl)

Template

2

10X reaction buffer

2

dNTPs

2

primer1

1

primer2

1

Taq polymerase

0.5

D.W

11.5

Total mixture

20

 

 

2. PCR tube에 아래 표와 같이 micro pipet으로 정밀하게 첨가해준다.

 

3. 1%gel을 만들기 위해서 40ml1X TAE0.4gAgarose gel가루를 넣고 hot plate2분 정도 돌려 투명하게 녹인다.

 

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​사진1. 0.1% Agarose gel을 만들기 위해 0.5g의 agarose를 재고 있다.

 

 

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사진2, 3. TAE buffer에 Agarose gel 파우더를 녹여0.1% Agarose gel을 만드는 모습이다.

 

4. 투명하게 녹은 gelgel red를 넣고 공기방울이 생기지 않도록 조심하며 gel 성형 틀에 붓는다. gel의 위쪽에 콤을 끼워준 후 gel이 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.

 

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사진4만들어진 gel의 모습이다.

 

5. 전기영동 기기에 1X TAE를 채운 뒤 굳은 gel을 넣어준다. 제일 앞 홈에 DNA size marker2μl 넣는다.

 

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사진5. 가공된 DNA에 loading를 추가하는 모습이다.

 

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사진6. 전기영동 gel에 loading하고 있다.

 

6. 2μlloading dye를 증폭 산물에 섞어 총 22μl를 전기영동 gel 홈에 차례대로 넣는다.

 

7. gel100-150V30분정도 내리고 UVlight에 쬐여 결과를 확인한다.

 

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사진7. 전기영동 결과를 UVlight를 이용하여 확인하고 있다.

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사진8. 전기영동 결과이다.

 

 

 

 

. 제한효소작용 확인


 

sample1 (μl)

sample2 (μl)

Plasmid DNA

1

1

10X buffer

1

1

Restriction Enzyme

BamHI : 0.5

BamHI : 0.5

 

 

EcoRI : 0.5

D.W

7.5

7

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