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생명과학 | PCR 기법을 이용한 미토콘드리아 DNA 증폭​

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작성자 캠프 담당자 작성일17-01-17 17:27 조회916회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험토론캠프

 

 

1.실험목표

 

- 쥐의 간 조직으로부터 유전자를 추출한다.

- 유전자 증폭에 이용되는 PCR의 원리를 이해한다.

- 전기영동을 이용하여 증폭 산물을 비교하고, 염기서열 분석을 통해 동물계통분류를 이해한다.

 

  

 

2. 실험재료

 

DNA, 프라이머(10pmol), Taq polymerase, D.W, 10X reaction buffer, 1XTAE buffer, 아가로오즈 겔 파우더, gel red, DNA loading dye, DNA size marker(1Kb), spin column, lysis buffer, 70%에탄올, wash buffer

 

  

 

3. 실험기구

 

PCR 기기, micro pipet과 피펫 팁, 아이스팩, PCR tube, PCR tube rack, 1.5ml tuberack, 호일랩, 폴리글러브, 라텍스 글러브, Et-OH 분무기, 네임펜, 전기영동장치, UV light, gel tray, microwave oven, 전자저울, 약수저, 삼각플라스크, 거름종이, 핸드페이퍼, 원심분리기

 

 

 

4. 실험방법  

 

. 쥐의 간 조직으로부터 유전자 추출


1. 5mm*5mm로 자른 조직을 잘게 썰어 tube에 넣고 lysis버퍼를 추가하여 15분간 반응시킨다.

2. 파쇄물의 상층액을 spin column에 넣고 원심분리를 하여 binding한다.

3. 70% 에탄올을 넣고 원심분리한다.

4. 걸러져나온 용액을 버리고 wash buffer를 넣은 후 원심분리한다.

5. 4번 과정을 반복한다.

6. 멸균된 증류수를 약 20ul 넣고 약 2분간 반응시킨다.

7. 원심분리 이후 RNA를 추출한다. 

 

 

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사진1. 간조직에 lysis buffer을 추가하여 반응시키는 모습이다.

 

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​사진2. 상층액을 spin column으로 옮기는 과정이다.

 

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사진3. 원심분리기를 이용하여 RNA만을 추출하는 과정이다.

 

 

 

. Polymerase Chain Reaction


1. 전체 실험은 PCR 기기에 넣기 전까지 아이스팩 위에서 진행한다.

2. 5.6ulsolutionA(dNTPs+쥐의 primer+10Xreaction buffer)DNA-A라 적힌 PCR tube에 넣는다. 넣을 때 시료가 tube 바닥에 잘 들어간 것을 확인한다.

3. 5.6ulsolutionB(dNTPs+조류의 primer+10Xreaction buffer)DNA-B라 적힌 PCR tube에 넣는다. 넣을 때 시료가 tube 바닥에 잘 들어간 것을 확인한다.

4. 0.2ulTaq polymerase를 모든 PCR tube에 넣는다.

5. 14.2ulDNA를 모든 PCR tube에 넣고 파이펫을 이용해 조심스럽게 섞어준다.

6. 프로그래밍된 PCR 기기에 완성된 tube들을 넣고 증폭시킨다.

 

 

 


. 전기영동

​​1. 1%gel을 만들기 위해서 40ml1X TAE0.4gAgarose gel가루를 넣고 hot plate2분 정도 돌려 투명하게 녹인다.

2. 투명하게 녹은 gelgel red를 넣고 공기방울이 생기지 않도록 조심하며 gel 성형 틀에 붓는다. gel의 위쪽에 콤을 끼워준 후 gel이 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.

3. 전기영동 기기에 1X TAE를 채운 뒤 굳은 gel을 넣어준다. 제일 앞 홈에 DNA size marker1μl 넣고 순서대로 roading dye를 섞은 증폭 산물을 1μl씩 넣는다.

4. 100V에서 30분 전기영동 한다. 전기영동 중간에 직접 눈으로 각각의 홈에서 증폭산물이 아래로 내려오는 것을 확인 할 수 있다.

5. 전기영동이 끝나면 gelgel tray에 담아 UV light기에서 미토콘드리아 DNA의 증폭 여부를 확인하고 첫줄의 사이즈 마커와 비교하여 그 사이즈를 추축한다. 또한 사용한 유전자가 어떤 프라이머에 반응하여 증폭이 일어나는지를 통해 어떤 동물의 유전자인지 생각한다.

 

주의사항

- spin column을 사용하여 유전자를 추출할 때에 마지막 단계에서 내려온 유전자를 버리지 않도록 주의한다.

- 젤에 DNAloading할 때에 젤을 찢지 않도록 주의한다. 

 

 

 

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사진4. 1X TAE를 만들기 위해 50X TAE를 희석하고 있다.

 

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​사진5. 0.1% Agarose gel을 만들기 위해 0.5gagarose를 재고 있다.

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사진6. 0.1% Agarose gel 용액을 만들고 있다.

 

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사진7. 만들어진 gel의 모습이다.

 

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사진8. GelDNAloading 하는 모습

 

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사진9. 전기영동 결과이다.

 

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